Analisi del profilo di espressione dei microRNA in cellule alfa e beta pancreatiche di topo dopo trattamento con citochine

Abstract

Premessa I microRNA occupano una posizione gerarchicamente critica nella regolazione delle networks cellulari e sono quindi candidati di rilievo per un coinvolgimento patogenetico in patologie sistemiche, quali le neoplasie e le malattie degenerative. Di conseguenza, queste molecole sono concordemente ritenute i biomarcatori di nuova generazione piu' promettenti per la diagnosi, per la prognosi ed il disegno di interventi terapeutici innovativi: e' facile ipotizzare che la disponibilita ' di batterie di microRNA, ben caratterizzati dal punto di vista molecolare, strettamente associati alla patologia di interesse, e presenti nel siero, dovrebbe modificare in modo radicale le modalita' operative e le prospettive di successo nell' ambito della Medicina clinica. Obiettivo del nostro lavoro e' stato quello di contribuire alla caratterizzazione del ruolo dei microRNA nella patogenesi del Diabete Mellito (DM), ed identificare e caratterizzare un set di microRNA da utilizzare quali biomarcatori molecolari e potenziali bersagli terapeutici di tale patologia, la cui incidenza e' aumentata a livello mondiale a tal punto da giustificare l ' utilizzo del termine epidemia. Nonostante una estesa bibliografia, e' evidente che le basi molecolari del DM non sono state sufficientemente studiate a livello di sistema.

Materiali e Metodi Abbiamo sfruttato un sistema modello che mima gli eventi infiammatori occorrenti in vivo in pazienti diabetici. In particolare abbiamo analizzato il trascrittoma di 518 microRNA in cellule alfa e beta pancreatiche murine (alfaTC1 e betaTC1), mediante analisi High Throughput (HT) effettuata con TaqMan Low Density Arrays per la PCR Real-Time. Le cellule sono state analizzate sia a steady state che dopo induzione di apoptosi con un cocktail di citochine (IFN-gamma, IL-1beta, TNF-alfa) per diversi tempi di esposizione (24h e 48h). Sono stati considerati differenzialmente espressi (DE) i microRNA che presentavano variazioni nell ' espressione (Fold change) di almeno 3 volte (verso l ' alto o verso il basso) nei trattati rispetto ai relativi controlli (FC maggiore o uguale a 3 o minore o uguale a 0.33) e comuni a tre controlli endogeni (snoRNA135, snoRNA202 e MammalU6). I microRNA differenzialmente espressi ottenuti sono stati ulteriormente filtrati effettuando un Paired T-Test. Una successiva analisi in silico ci ha permesso di individuare i targets predetti e validati dei miRNA DE.

Risultati e Discussione Le nostre analisi hanno permesso di verificare che l ' esposizione prolungata e ad alte concentrazioni delle linee cellulari murine di glucagonoma (alfaTC1) e di insulinoma (betaTC1) al cocktail di citochine pro-infiammatorie induce marcati cambiamenti nell ' espressione dei microRNA rispetto a quanto avviene nelle stesse cellule in condizioni non perturbate ed in misura maggiore nelle betaTC1 piuttosto che nelle alfaTC1. Abbiamo identificato, nel complesso, il 6,18% (32/518) di microRNA con espressione significativamente alterata in entrambe le linee cellulari (tra questi il miR-146a, il miR-21 e il miR-34a risultano essere gia' noti in letteratura come coinvolti nel processo di secrezione insulinica nelle beta cellule e nella loro proliferazione e apoptosi). Nelle alfaTC1 sono risultati differenzialmente espressi 12 miRNA, di cui 4 risultano essere specifici del time point a 24h, 6 del time point a 48h, e 2 presentano una disregolazione costante durante l ' intero time course. Nelle betaTC1 mostrano espressione differenziale 25 miRNA, di cui 2 risultano essere specifici del time point a 24h, 13 del time point a 48h, e 10 mostrano una espressione alterata sia a 24h che a 48h. La costante disregolazione nei due time point suggerisce che tali miRNA possano avere un importante ruolo nella cascata di segnali scatenata dalle citochine. Considerando l ' intero time course si nota che 7 miRNA sono alterati in maniera specifica nelle alfaTC1, 20 nelle betaTC1 e 5 (miR-125b-5p, miR-146a, miR-155, miR-203 e miR-21) sono sovraespressi in entrambi i fenotipi cellulari. L ' induzione di miRNA sia nelle alfaTC1 che nelle betaTC1 potrebbe rappresentare un meccanismo fisiologico di risposta all ' azione delle citochine comune fra due fenotipi cellulari che condividono la stessa origine endodermica. La nostra attenzione si e' rivolta in modo particolare ai miRNA che presentano una importante alterazione dell ' espressione in una linea rispetto all ' altra, considerando anche il confronto tra i due fenotipi cellulari a steady state; maggiore importanza e' stata data ai microRNA che mostrano variazione di espressione di segno opposto nelle due linee cellulari dopo trattamento, e livelli di espressione opposti nella stessa linea cellulare prima e dopo l ' esposizione a citochine. Da questo punto di vista miR-216a, miR-216b e miR-217 rappresentano microRNA particolarmente interessanti sui quali svolgere esperimenti di genomica funzionale ai fini di verificare un possibile coinvolgimento nel Diabete Mellito (in letteratura non e' attualmente riportata alcuna correlazione tra questi miRNA e la malattia). Inoltre alcuni tra i targets predetti e validati dei DE miRNA ottenuti mediante analisi in silico sono risultati appartenere al set di geni di seconda classe candidati per il Diabete ottenuto in un lavoro recentemente completato dal nostro gruppo di ricerca [Barbagallo et al., in preparazione]: tra questi Stat3 (bersaglio dei miR-125b-5p e miR-21) e Bbc3, target del miR-148a.

Conclusioni I nostri dati hanno descritto per la prima volta l ' assetto molecolare dei microRNA nelle alfa cellule pancreatiche dopo loro esposizione ad un cocktail di citochine pro-infiammatorie, oltre che gettare le basi per una migliore comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della morte delle beta cellule. Prospettive future di questo lavoro sono: l ' identificazione delle alterazioni di pathways e networks coinvolte dopo trattamento delle cellule in vitro; la validazione dei piu' credibili tra i microRNA candidati mediante trasfezione di anti- o di pre-miRNA per determinarne il silenziamento o l ' attivazione funzionale. Mediante l ' integrazione dei dati ottenuti verra' prodotta una lista completa di microRNA, dei loro potenziali bersagli proteici e delle pathways coinvolte nell ' alterazione del fenotipo cellulare e molecolare delle cellule alfa e beta pancreatiche, in un sistema in vitro che riproduce in modo credibile le condizioni che si verificano in vivo nei pazienti durante l ' insorgenza del Diabete Mellito.

Background MicroRNAs are in a critically hierarchic position within cellular networks, whose functioning they regulate: therefore, they are important candidates for being involved in the pathogenesis of complex systemic diseases like cancer and degenerative diseases. Accordingly, these molecules are unanimously considered the most promising new generation ' s biomarkers for diagnosis, prognosis and designing novel therapeutic interventions: it is easy to expect that the availability of batteries of well characterized microRNAs, closely associated to the disease of interest and present in the serum, would radically change the operating modes and the prospects of success in Clinical Medicine. The main aims of this project was to contribute to the characterization of microRNAs' role in the pathogenesis of Diabetes Mellitus (DM) and to identify and characterize a set of microRNAs to be used as molecular biomarkers and potential therapeutic targets of DM. The incidence of this disease is increasing worldwide, so that many authors have defined this phenomenon an epidemy. Despite the large volume of literature data on DM, it is evident that our knowledge of its pathogenetic mechanisms should be greatly expanded.

Methods We used a model system that mimics the inflammatory events occurring in vivo in diabetic patients. In particular, we analyzed the transcriptome of 518 microRNAs in mouse pancreatic alpha and beta cells (alphaTC1 and betaTC1), by performing a High Throughput (HT) analysis with TaqMan Low Density Arrays (TLDA) for PCR Real-Time. We analyzed cells both at steady state and after inducing apoptosis with a cocktail of cytokines (IFN-gamma, IL-1beta, TNF-alpha) for different times of exposure (24h and 48h). We considered as up- or downregulated those miRNA that have a natural logarithm of expression fold change of at least 1 or greater and -1 or less, respectively. Data normalization was performed by using snoRNA135, snoRNA202 and MammalU6 as endogenous controls. Differentially expressed microRNAs (DE miRNAs) obtained were further filtered by performing a Paired T-Test. A subsequent in silico analysis allowed us to identify the predicted and validated targets of DE miRNAs.

Results and Discussion Our experimental data demonstrate that prolonged exposure of alphaTC1 and betaTC1 to high concentrations of pro-inflammatory cytokines induces marked changes in miRNAs expression compared to the same cells under physiological conditions, and to a greater extent in betaTC1 than in alphaTC1. We identified 6.18% (32/518) of microRNAs with significantly altered expression in both cell lines (miR-146a, miR-21 and miR-34a had been previously reported to be involved in beta cells insulin secretion, proliferation and apoptosis). In alphaTC1 post treatment (PT) we found 12 differentially expressed miRNAs, 4 of which are specifically altered at 24h and 6 specifically altered at 48h, whereas 2 miRNAs show a constant dysregulation throughout the time course. In betaTC1 we observed that 25 miRNAs show differential expression post cytokines treatment, 2 of which are specifics of 24h time point, 13 are specifics of 48h and 10 show altered expression in both time points. The altered expression of these miRNAs at 24h and 48h PT in the 2 cell lines could suggest their important role within the signaling cascade triggered by cytokines. Considering the entire time course, 7 miRNAs are specifically altered in alphaTC1, 20 are specifically altered in betaTC1, and 5 miRNAs (miR-125b-5p, miR-146a, miR-155, miR-203 and miR-21) are over expressed in both cell phenotypes. The induction of some miRNAs in both alphaTC1 and betaTC1 could be a physiological response to cytokines action common to both cell phenotypes sharing the same endodermal origin. We have focused our attention particularly to miRNAs with an important altered expression in a cell line compared to the other, considering also the comparison between the two cell phenotypes at steady state; we gave more importance to microRNAs showed expression variation of opposite sign in the two cell lines after treatment, and opposite expression levels in the same cell line before and after cytokines exposure. From this point of view, miR-216a, miR-216b and miR-217 are particularly interesting DE miRNAs; these miRNAs will be selected to perform functional genomics experiments in order to verify a possible involvement in Diabetes (in literature is not currently reported any correlation between these miRNAs and Diabetes). In addition, some of the DE miRNAs predicted and validated targets obtained by in silico analysis were found to belong to the set of Diabetes candidate genes obtained in a work recently completed by our research group [Barbagallo et al., manuscript in preparation]: these include Stat3 (target of miR-125b-5p and miR-21) and Bbc3, target of miR-148a.

Conclusions and Perspectives It is important to emphasize that this is the first HT profiling study of microRNAs in pancreatic alpha cells, both at steady state and after treatment with cytokines; we have also contribute to a better understanding of the molecular mechanisms responsible for beta cells death. Future aims of this project are to reconstruct through computational analysis the pathways and networks involved and to identify their alterations after apoptosis induction, and validate the most credible among candidates microRNAs by transfection of anti- or pre-miRNA to determine silencing or functional activation. Through the integration of these data we will obtain a complete list of microRNAs, their targets proteins and corresponding pathways, involved in alteration of the cellular and molecular phenotype of pancreatic alpha and beta cells, in an in vitro system that credibly reproduces the conditions that occur in vivo in patients during the onset and progression of Diabetes.