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Data: 4-mag-2011
Autori: Fidilio, Annamaria
Titolo: Ruolo dell Inotuzumab Ozogamicin (CMC-544) nell induzione dell apoptosi in cellule CD22-positive di patologie linfoproliferative
Abstract: In questo progetto di ricerca, abbiamo descritto i meccanismi molecolari innescati dall'Inotuzumab Ozogamicina (CMC-544), un anticorpo anti-CD22 coniugato con la calichemicina, in linee immortalizzate ed in colture primarie di cellule linfoidi derivate da patologie linfoproliferative CD22-positive. Abbiamo utilizzato due linee cellulari derivate da linfoma di Burkitt (BL-2, RAJI, NAMALWA), una linea derivata da leucemia a precursori linfoidi B (SUP-B15) e una linea derivata da leucemia mieloide acuta (HL-60) come linea cellulare di controllo. Le cellule sono state trattate con il CMC-544 o il Gemtuzumab Ozogamicina (CMA-676), un anticorpo anti-CD33 coniugato con la calichemicina. Le linee cellulari BL-2 e SUP-B15 mostrano valori di IC50 per il CMC-544 significativamente piu' bassi rispetto a quelli ottenuti dopo trattamento con il CMA-676. Tuttavia, le RAJI e le NAMALWA presentano valori di IC50 simili per entrambi gli immunoconiugati, anche se presentano una bassa percentuale dell'antigene di superficie CD33. Inoltre, mentre le BL-2 e le SUP-B15 sopravvissute al trattamento per 48 ore con il CMC-544 sono arrestate in fase G2/M del ciclo cellulare, le RAJI e le NAMALWA - che presentano una mutazione nella sequenza amminoacidica della proteina p53 non solo non sono in grado di bloccarsi, ma l'esposizione all'immunoconiugato genera una popolazione poliploide. Nonostante cio', gli esperimenti di citofluorimetria, per valutare la distribuzione del ciclo cellulare, dimostrano che il trattamento con il CMC-544 per 12 ore induce un arresto in fase G2/M p53-indipendente in tutte le linee cellulari CD22-positive. Quando abbiamo ripetuto gli stessi esperimenti usando una combinazione sequenziale del CMC-544 e dellà à à à à ¢ UCN-01, un inibitore di ChK2, abbiamo osservato un significativo incremento della morte cellulare. Il trattamento per 48 ore con il CMC-544 determina un arresto in fase G2/M del ciclo cellulare solo nelle BL-2 e SUP-B15, un evento fortemente ridotto dopo esposizione all'UCN-01. Tuttavia, le RAJI e le NAMALWA à à à à à ¢ mancando del blocco in fase G2/M dopo 48 ore d'esposizione al CMC-544 - non rispondono al trattamento con l'UCN-01. Nonostante cio', l'espressione ectopica di p53 wild-type nelle NAMALWA le ha rese sensibili al trattamento con il CMC-544 ed ha generato un incremento della morte cellulare. Abbiamo, inoltre, confermato il valore predittivo dello status di p53 nel determinare la sensibilita' al trattamento con il CMC-544 anche in colture primarie derivate da pazienti affetti da patologie linfoproliferative CD22-positive. In conclusione, il CMC-544 mostra un alto potenziale terapeutico in cellule immortalizzate ed in linee primarie linfoidi CD22-positive. Lo status mutazionale della proteina p53 potrebbe rappresentare un marcatore molecolare di risposta al CMC-544 sia in vitro che in vivo. Inoltre, la combinazione con un inibitore della protein-chinasi ChK2 potrebbe ripristinare l'attivita' dell'immunoconiugato in pazienti con patologie linfoproliferative CD22-positive che presentano mutazioni nella proteina p53.
We describe the molecular mechanisms underlying the efficacy of a novel anti-CD22 calicheamicin immunoconjugate (anti-CD22 CalichDMH). We investigated the mechanisms responsible for the anti-proliferative effect of the compound on both immortalized and primary lymphoid cells derived from CD22-positive malignancies. We employed BL-2, RAJI, SUP-B15 and NAMALWA CD22-positive cell lines and HL-60 CD22-negative cells, as a control. Cells were exposed to the anti-CD22 CalichDMH or Gemtuzumab Ozogamicin (CMA-676, an anti-CD33 immunoconjugate). BL-2 and SUP-B15 displayed significantly lower IC50 values for the anti-CD22 CalichDMH than for CMA-676. However, RAJI and NAMALWA showed a similar IC50 for both immunoconjugates, despite their marginal CD33 levels. BL-2 and SUP-B15 surviving 48 hours of anti-CD22 CalichDMH mostly arrested in the G2/M phase of the cell cycle. Conversely, RAJI and NAMALWA cells - harboring mutant p53 - failed to arrest in G2/M and accumulated an endopolyploid population. Fluocytometry experiments determined that 12 hours of anti-CD22 CalichDMH induced a p53-independent G2/M arrest in all CD22-positive cell lines. When we repeated these experiments using the sequential combination of the anti-CD22 CalichDMH and UCN-01 (a ChK1/2 inhibitor), we detected a significant increase in the amount of cell death. After 48 hours of anti-CD22 CalichDMH, we found that only BL-2 and SUP-B15 (both p53 wild-type) sustained their G2/M arrest and this event was abolished after UCN-01 treatment, again leading to an increase in apoptosis. However, RAJI and NAMALWA cells - devoid of a functional p53 - failed to maintain their G2/M block and generated endopolyploid cells, unresponsive to UCN-01. Forcing wild-type p53 expression in NAMALWA cells restored anti-CD22 CalichDMH sensitivity and led to increased cell death. The predictive value of p53 status in determing the IC50 of the anti-CD22 CalichDMH was confirmed in primary CD22-positive cells, displaying wild-type or mutant p53, derived from patients with limphoproliferative disorder. This novel anti-CD22 CalichDMH displays potent therapeutic activity against both immortalized and primary CD22-positive lymphoid cells. p53 mutational status might represent a predictive biomarker of anti-CD22 CalichDMH efficacy both in vitro and in vivo. Associating a ChK2 inhibitor could restore anti-CD22 CalichDMH activity in CD22-positive lymphoproliferative cells displaying mutant p53.
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