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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10761/293

Issue Date: 5-May-2011
Authors: Daden, Mounia
Title: Further Characterization studies on Citrus Tristeza Virus (CTV) isolates collection from Mediterranen countries and their interaction with citrus viroids
Abstract: The biological properties of a collection of citrus tristeza virus (CTV) isolates from 13 Citrus-growing countries were investigated, these lasts were mostly from the Mediterranean area that was thought for long time free from severe CTV isolates. These study confirmed the presence of such isolates in the area, as a lot of biologically indexed isolates were able to produce even stem pitting on Madam vinous Sweet Orange (SwO) considered the most dangerous strain. The symptoms expressed on the standard set of CTV indicator plants; Mexican lime (M.L), Duncan grapefruit (Gft), sour orange (SO) seedlings, Madam Vinous SwO grafted on sour orange, sour orange (SO) seedlings, and Madam Vinous SwO seedlings enables the establishment of the various Biogroups that are present in the Mediterranean Area ranging from the severe Biogroups 4 and 5 mostly in the Middle East region to and the Mild Biogroup 1 in other regions. Interestingly, all the isolates belonging to the Biogroups 4 and 5 gave a positive reaction with the MCA13 MAbs that was produced to discriminate between mild and severe CTV isolates in Florida, but it failed to detect others elsewhere. Such rapid tests are of important concern and are needed to identify isolates that have potential economic impact in commercial citrus groves and to adopt a sound CTV management strategy. But discriminative analysis needed have to be, as rapid as reliable, and this was another aim of this work; finding potential molecular markers that could be used for sensitive and quick identification of virulent CTV isolates through the study of a Mediterranean CTV collection. For this purpose 27 CTV isolates were compared for symptom expression and by conventional Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) and Capillary Electrophoresis CE-SSCP analysis of four 3à à ¢ à à ² terminal genes (p18, p20, p27 and p23) and the analysis genetic variation by sequencing. The conventional SSCP is a relatively robust and easy to perform procedure, and is a good primary molecular differentiation for CTV isolates, but it has as main limitation the non quantification of profile differences in terms of the genetic distance between the corresponding DNA fragments providing therefore only a qualitative picture of the variation. CE-SSCP, as alternative to gel slab techniques has become a promising alternative to gel based SSCP methods, presents the advantages of high sensitivity, high specificity and is easy to perform. The technique was able to distinguish between a set of already known sequence differences and the repeatability of the results within and between different runs was also evaluated. A great diversity of SSCP profiles was observed among isolates for the genes studied for both the methods and some isolates of the same biogroups displayed the same haplotype, with both conventional and F-SSCP analysis, mostly for the p20 gene, even if they were from different geographical origin. Other field CTV isolates have to be phenotyped and subjected to other conventional and Fluorescent SSCP tests so that the proposed models can be verified, confirmed or modified.
Le proprieta' biologiche di una collezione di isolati del virus della tristeza degli agrumi (CTV) afferenti a 13 paesi produttori di agrumi, prevalentemente Mediterranei, un area per molto tempo indenne da severi isolati di CTV, sono stati indagati. Lo studio ha confermato la presenza di tali isolati nella zona, visto che molti isolati saggiati biologicamente sono stati in grado di indurre anche la butteratura del legno sull'Arancio dolce Madam vinous considerato sintomo specifico indotto dai ceppi piu' pericolosi del virus. I sintomi espressi da 27 isolati d CTV sul set standard delle piante indicatrice; Limetta messicana, Pompelmo duncan, Arancio amaro da semenzale, l'Arancio dolce Madam vinous e l'Arancio dolce innestato su Arancio amaro ha consentito la definizione dei Biogruppi che sono presenti nel Mediterraneo che variano dai severi Biogruppi 4 e 5, per lo piu' nella zona del Medio Oriente, al Biogruppo di ceppi blandi nelle atre zone. E' interessante specificare che tutti gli isolati appartenenti al Biogruppo 4 e 5 hanno dato una reazione positiva con l'anticorpo monoclonale MCA13, prodotto per individuare i ceppi severi del CTV in Florida, ma che si e' rivelato a volte inefficace per rilevarne altri altrove. Tali test diagnostici rapidi sono di grande importanza e sono necessari per identificare gli isolati che hanno un potenziale impatto economico in agrumeti commerciali e per adottare una strategia di lotta adatta ai ceppi di CTV ritrovati in campo. Ma le analisi discriminatorie devono essere quanto piu' rapide che affidabile, e questo era un altro obiettivo di questo lavoro, trovare potenziali marcatori molecolari che potrebbero essere utilizzati per un identificazione sensibile e veloce di isolati virulenti di CTV attraverso lo studio di una collezione di CTV del Mediterraneo. A tal fine, l'espressione dei sintomi e i Biogruppi ottenuti per i 27 isolati studiati sono stati confrontati con i risultati ottenuti con il metodo convenzionale del Polimorfismo di Conformazione dei Singoli Filamenti (SSCP) e con l'Elettroforesi Capillare del Polimorfismo di Conformazione dei Singoli Filamenti (CE-SSCP) per i quattro geni (p18, p20, p23 e p23) e con le variazione genetiche mediante il sequenziamento. La SSCP convenzionale e' una procedura relativamente robusta e facile da eseguire ed e'una buona differenziazione molecolare primaria tra gli isolati di CTV, ma presenta come limitazione principale la non quantificazione delle differenze di profili ottenuti in termini di distanza genetica con i frammenti corrispondenti di DNA fornendo quindi solo una rappresentazione qualitativa della variazione. La CE-SSCP, in alternativa alla tecnica con il gel di polyacrylamide, e' diventata una promettente alternativa al SSCP convenzionale e presenta i vantaggi di alta sensibilita', alta specificita' ed e' facile da eseguire. La tecnica e' stata in grado di distinguere tra una serie di sequenze gia' note come differenti e la ripetibilita' dei risultati e' stata valutata sia per la singola corsa che tra le diverse corse elettroforetiche. Una grande diversita' dei profili di SSCP e' stata osservata fra gli isolati per i geni studiati con entrambi i metodi ed alcuni isolati degli stessi Biogruppi hanno esibito lo stesso aplotipo sia con la SSCP convenzionale che con la capillare, principalmente per il gene p20, anche se provenivano da aree geografiche differenti. Altri isolati da CTV da campo devono essere sottoposti ad analisi del fenotipo e altre prove di SSCP convenzionale e fluorescenti, in modo da poter verificare, confermare o modificare i modelli proposti. Un'altra parte del lavoro che aveva come scopo studiare l'interazione tra CTV e i viroidi che colpiscono gli agrumi, ha dimostrato là ¢ incapsidazione dei viroidi dalla proteina di rivestimento del CTV. Questo fenomeno si e' rivelato piu' probabile quando le condizioni sono favorevoli per la moltiplicazione del CTV, ed e' stato confermato per i ceppi disponibili nella collezione di isolati e per i tre viroidi economicamente pià à ¹ importanti degli agrumi; il viroide della cachessia (CVd-II), il viroide dellà ¢ exocortite (CEVd) e il viroide del nanismo degli agrumi (CDVd). Questo fenomeno puo' permettere alle particelle del viroide di essere trasmesse da afidi vettori di CTV in agrumeto.
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