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Issue Date: 2-May-2011
Authors: Guagliano, Eleonora
Title: Modulazione della risposta cellulare allo stress ossidativo nell'invecchiamento e nelle patologie neurodegenerative
Abstract: Emerging evidence indicated that oxidative stress has been implicated in mechanisms leading to neuronal cell injury in various pathological states of the brain, including neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease (AD) and aging (1, 3, 8, 12, 36, 48, 66). Increasing evidence supports the notion that reduction of cellular expression and activity of antioxidant proteins and the resulting increase of oxidative stress are fundamental causes in the aging processes and neurodegenerative diseases (1, 9, 12, 34, 96, 249). As one of the main intracellular redox systems involved in neuroprotection, the vitagene system is emerging as a neurohormetic potential target for novel cytoprotective interventions (15, 17-18). In this study the importance of vitagenes in the cellular stress response and the potential use of dietary antioxidants in the prevention and treatment of neurodegenerative disorders, aging and systemic pathologies is discussed (12, 17, 251). The strong evidence that the vitagene network operates as a defense system in the brain during oxidative and nitrosative stress open new perspectives in the treatment of neurodegenerative disorders and other age-related diseases (2, 12, 14, 31, 249, 251). Taken together, these results suggest that the expression of Hsps increases with age and occurs as a consequence of redox state perturbation and this may have a role to limit the deleterious consequences associated with protein denaturation (1, 3, 5, 8, 12). Relevant to this, we devoted our recent interest to the development of nutritional interventions, including carnosine, able to target redox-sensitive cytoprotective genes, called vitagenes, involved in the homeostatic control of so-called longevity-assurance processes (2, 123, 251). In this study we tested the hypothesis that neurotoxicity is an important primary mediator of injury in Meniere's disease and may be reflected in measurable increases in markers of cellular stress response and oxidative stress in the peripheral blood of patients with Meniere's disease. The search for novel and more potent inducers of vitagenes will facilitate the development of pharmacological strategies to increase the intrinsic capacity of vulnerable ganglion cells to maximize antidegenerative mechanisms, such as stress response and thus cytoprotection (16, 18, 249, 251). Neurofibromatosis type 1 (NF1) is one of the most common autosomal dominant neurogenetic disorder. The mechanisms underlying NF1 clinical variability remain poorly understood, probably because of the involvement of complex pathophysiology and multiple factors. Neurofibromatosis type 1 (NF1) is a common monogenic tumor-predisposition disorder with an autosomal dominant pattern of inheritance that arises secondary to haploinsufficiency of the tumor suppressor gene NF1 (149, 284). The allelic heterogeneity of the constitutional NF1 mutation may be one of the factors explaining the disease phenotypic variability (285). Studies provided evidence for a strong genetic component and suggested the involvement of unlinked modifying genes and perhaps also of the normal NF1 allele, in the variable expression of the disease (285). The NF1 gene product, neurofibromin, is a cytoplasmic ubiquitously expressed protein of 2818 amino acids long, with structural and functional similarities to the mammalian GTPase-activating protein (GAP)-related protein family, a group of evolutionarily conserved proteins. Analysis of the predicted sequence of neurofibromin revealed that it likely functions as a negative regulator of Ras, a key intracellular signaling protein that is important for regulating cell growth and survival. Significant advances in the understanding of the pathophysiology of NF1 have been made in the last decade. Molecular testing is not indicated for the routine clinical care of patients with NF1, but can be helpful in individuals suspected of having NF1 (e.g. a young child with multiple cafà à à à à à à à à ©-au-lait spots and unaffected parents or a patient with a single criterion) or when prenatal or preimplantation genetic diagnosis is desired. Recently molecular testing for NF1 has become clinically available (188, 190). Because of the large size of the NF1 gene and the lack of mutation hotspots, a multi-step detection protocol is preferred. Efforts to identify and characterise all NF1 gene mutations continue to present a considerable research and diagnostic challenge due to a combination of the large gene size, the absence of any localised mutation clustering, little evidence of repeat mutation and the wide diversity of mutation types observed. Furthermore, the presence of a number of highly homologous partial NF1 pseudogene-like sequences located throughout the human genome has increased the complexity of PCR-based mutation analysis (150). According to this evidence, data illustrated in the present study clearly reported a wide spectrum of different types of mutations, including pathogenetic missense, nonsense, small deletions/insertions, which lead to the synthesis of an aberrant protein product. The data presented in this study indicate that splicing in NF1 gene is extremely complex (242-243). In fact, we identified heterozygous missense mutations in acceptor site or intraexonic causing codons in frame microdeletion or activating a criptic exon splicing site or causing exon skipping. All these mutations altered canonic mechanism of normal splicing causing aberrant transcripts formation (242-243). To better investigate smaller NF1 rearrangements, we performed multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) to screen of a number patients affected by NF1 for whom the presence of point mutations, small deletions and insertions had been previously excluded by sequencing analysis. Single and multi-exon NF1 copy-number changes, exclusively represented by NF1 gene entire deletion in our genetic test, were found in two different clinic case of patients with NF1. Our study enlarge knowledge and spectrum of NF1 gene mutations and underlie the importance of molecular-genetic tests on the basis also of the Neurofibromatoses clinic field characterization.
Emergenti evidenze sperimentali indicano il coinvolgimento dello stress ossidativo alla base dei meccanismi patogenetici che portano al danno neuronale in diverse condizioni patologiche, inclusi i disordini neurodegenerativi, quali la malattia di Alzheimer e l'invecchiamento fisiologico (1, 3, 8, 12, 36, 48, 66). Le attuali evidenze suggeriscono che, in generale, la riduzione dell'espressione cellulare e dell'attivita' di proteine antiossidanti associata ad una diminuzione nell'efficienza dei meccanismi cellulari di riparazione e di degradazione ed il conseguente incremento dei livelli di stress ossidativo e/o nitrosativo rappresentano una delle cause fondamentali sia dei normali processi d'invecchiamento che delle principali malattie neurodegenerative (1, 9, 12, 34, 96, 249). Uno dei principali sistemi redox intracellulari coinvolti nella neuroprotezione, il sistema dei vitageni, dato principalmente dal sistema delle proteine Hsps, e' emerso quale potenziale neurormetico target di innovative strategie terapeutiche citoprotettive (15, 17-18). I dati del presente studio sperimentale indicano l'importanza del sistema dei vitageni alla base della risposta cellulare allo stress e il potenziale impiego di antiossidanti nutrizionali, nella prevenzione e nel trattamento dei disordini neurodegenerativi, dell'invecchiamento e delle patologie sistemiche (12, 17, 251). L'emergente evidenza sperimentale in base alla quale il network dei vitageni opera quale sistema di difesa nel cervello in seguito ad aumentati livelli di stress ossidativo e/o nitrosativo apre nuove prospettive nel campo della medicina per il trattamento dei disordini neurodegenerativi e di altre patologie eta'à à à à à à  -dipendenti (2, 12, 14, 31, 249, 251). Considerate in una visione d'insieme, i dati sperimentali del presente studio indicano che l'espressione delle Hsps aumenta durante l'invecchiamento ed in presenza di alterazioni dello stato redox, al fine di limitare le conseguenze deleterie date dall'eccessiva produzione di proteine alterate ossidativamente (1, 3, 5, 8, 12). Riguardo cioe', abbiamo rivolto il nostro interesse verso lo sviluppo di innovativi interventi nutrizionali, dati da antiossidanti presenti nella dieta, quali la carnosina, aventi come target tali geni citoprotettivi redox-sensitivi, definiti vitageni, coinvolti nella neuroprotezione e nel mantenimento dell'omeostasi e dei processi che assicurano la longevita' (2, 123, 251). Nel presente studio abbiamo testato, inoltre, l'ipotesi sperimentale in base alla quale la neurotossicita' rappresenta un importante mediatore primario di danno nella sindrome di Menierà à à à à à à © cio' puo' essere spiegato da aumentati livelli di biomarkers di risposta cellulare allo stress quantificabili in campioni di sangue periferico di pazienti affetti. Di conseguenza, la ricerca di innovativi e potenti induttori del sistema dei vitageni apre nuove prospettive per lo sviluppo di originali strategie farmacologiche in grado di dare citoprotezione e di massimizzare i meccanismi antidegenerativi, inclusa la risposta cellulare allo stress, anche nei neuroni gangliari a spirale dell'apparato cocleovestibolare, riducendo i principali segni clinici associati alla sindrome di Menierà à à à à à à © (16, 18, 249, 251). La Neurofibromatosi di tipo 1 (NF1), o neurofibromatosi classica o periferica, e' uno dei piu' comuni disordini neurogenetici ereditari a carattere autosomico dominante. Il meccanismo molecolare che sta alla base della variabilita' clinica di tale sindrome multisistemica rimane ancora non del tutto conosciuto, probabilmente per la complessita' dei molteplici fattori coinvolti nella sua patofisiologia. La Neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) e' una condizione genetica multisistemica la quale origina da mutazioni allo stato eterozigote, inattivanti il gene tumor suppressor NF1, localizzato nella regione pericentromerica del cromosoma umano 17 (17q11.2). L' eterogeneita' allelica delle mutazioni che interessano il gene NF1 rappresenta uno dei fattori che spiega l'eterogeneita' fenotipica (285). Studi clinici e sperimentali dimostrano l'esistenza di una forte componente genetica e suggeriscono il coinvolgimento di geni modificatori alla base della variabilita' di espressione di tale disordine neurogenetico (285). Il prodotto del gene NF1, la neurofibromina, e' una proteina ubiquitaria citoplasmatica di 2818 residui aminoacidici, con una struttura e funzione simili a quelle delle proteine GAP (GTPasi-activating protein), un gruppo di proteine conservate evolutivamente. L'analisi della struttura della neurofibromina ha permesso di identificarla quale regolatore negativo della proteina Ras, una proteina chiave intracellulare coinvolta nel signaling pathway che regola i processi di crescita e di sopravvivenza cellulare. Significativi progressi scientifici sono stati raggiunti nell'ultima decade per quanto riguarda la comprensione dei principali meccanismi molecolari alla base della patofisiologia di tale sindrome genetica multisistemica. L'analisi mutazionale del gene NF1 ed i test genetici vengono utilizzati quale supporto e conferma della diagnosi clinica, soprattutto in quei casi clinici che non soddisfano pienamente i criteri diagnostici o quando la diagnosi prenatale e' richiesta. Recentemente, test molecolari sono stati resi disponibili clinicamente per la diagnosi genetica di Neurofibromatosi di tipo 1 (188, 190). A causa dell'enorme grandezza e complessita' del gene NF1, della mancanza di siti hotspots mutazionali noti, dell'estrema variabilita' fenotipica e della presenza di pseudogeni, in genere e' richiesto un protocollo multi-step per la diagnosi molecolare di NF1 (150). In accordo ad evidenze cliniche e sperimentali, i dati riportati nel presente studio mostrano chiaramente la presenza di un ampio spettro di differenti tipi di mutazioni riscontrate in diversi casi clinici, incluse mutazioni patogenetiche missense, nonsense, piccole delezioni/inserzioni, le quali portano alla sintesi di un prodotto proteico aberrante. I dati sperimentali e clinici del presente studio indicano che il meccanismo di splicing nel gene NF1 e' estremamente complesso (242-243). Infatti, nel nostro laboratorio abbiamo identificato in diversi casi clinici delle mutazioni missense nel sito accettore di splicing o intraesoniche, nel gene NF1 allo stato eterozigote, le quali possono causare o la microdelezione in frame di codoni, o attivare siti criptici di splicing intraesonici o addirittura promuovere lo skipping dell'esone di interesse. In tutti questi casi si ha una profonda alterazione dei meccanismi canonici di splicing, la quale determina la formazione di trascritti aberranti e patogenetici (242-243). Per di piu', al fine di identificare ridotti riarrangiamenti del gene NF1, incluse piccole delezioni/duplicazioni, abbiamo adottato recentemente nel nostro laboratorio un nuovo protocollo diagnostico basato sull'impiego della tecnica MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification), per testare tutti i casi clinici NF1 risultati negativi al sequenziamento diretto per la ricerca di mutazioni puntiformi (180, 207). Il nostro studio, pertanto, amplia le conoscenze e lo spettro delle mutazioni relative al gene NF1 e sottolinea l'importanza dell'analisi genetico-molecolare alla base di una caratterizzazione diagnostica anche nel campo clinico delle Neurofibromatosi.
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