Caratterizzazione di isolati del virus della tristeza degli agrumi mediante elettroforesi capillare della conformazione dei polimorfismi del singolo filamento (CE-SSCP) e messa a punto di protocolli di analisi rapida.

Abstract

Citrus tristeza virus (CTV) e' una specie virale del genere Closterovirus che causa una delle malattie piu' dannose per l'agrumicoltura. Il CTV ha portato alla morte oltre 85 milioni di piante di agrumi in tutto il mondo e reso economicamente improduttive altrettante. L'uso di portinnesti tolleranti consente di arginare gli effetti di alcuni ceppi del virus ma non di tutti. L'eradicazione delle piante infette e' una strategia di lotta efficace, perseguita in molti Paesi del mondo e valida fino al punto in cui la malattia non habbia ancora assunto livelli di diffusione superiori al 5%. Superato questo limite la ricerca e l'esperienza suggeriscono l'estirpazione limitata alle piante affette da ceppi virulenti e l'impiego di tecniche di protezione crociata o di interferenza. Per questo motivo, negli anni recenti, sono state messe a punto numerose tecniche per la caratterizzazione degli isolati di CTV. Oltre ai saggi biologici, troppo lunghi e costosi, affidabili sono l'uso di multiple-molecular-markers (MMM) (molto laborioso) ed il sequenziamento (non accessibile a tutti i laboratori). Informazioni utili puo' dare l'analisi della conformazione dei polimorfismi del filamento singolo (SSCP) della quale, nella ricerca oggetto del dottorato, si e' cercato di migliorare la potenzialita' attraverso l'elettroforesi capillare. La ricerca eseguita ha permesso di mettere a punto e validare protocolli di CE-SSCP (elettroforesi capillare dell'analisi della conformazione dei polimorfismi del filamento singolo) specifica per CTV. Questa tecnica abbina le potenzialita' della tradizionale tecnica SSCP ai vantaggi dell'elettroforesi capillare. Per la messa a punto del metodo sono stati utilizzati tre isolati provenienti dalla Sicilia (SG29, Tapi e TDV) e un isolato esotico (RPC3), precedentemente caratterizzati biologicamente. I prodotti dell'amplificazione dei geni p18 (425bp), p23 (594bp) e p25 (415bp) sono stati utilizzati per l'analisi SSCP e CE-SSCP. I profili ottenuti hanno permesso di clusterizzare gli isolati SG29, RPC3, TDV e Tapi in gruppi differenti. TDV e Tapi, isolati da piante provenienti dallo stesso vivaio e presenti in due appezzamenti contigui hanno mostrato profili simili, cosi' come tanti altri isolati provenienti da piante dell'areale. SG29 e RPC3 hanno mostrato sintomi gravi in tutte le piante indicatrici, mentre Tapi e TDV hanno mostrato sintomi tipici degli isolati blandi. Le analisi filogenetiche rivelano che questi due isolati sono localizzati in un cluster che comprende le varianti di sequenza dei ceppi blandi, mentre SG29 e RPC3 ricadono nel clado degli isolati virulenti. In base ai risultati ottenuti la tecnica e' stata utilizzata per caratterizzare 54 isolati di CTV provenienti da diversi areali della Sicilia, ai fini della validazione e della definizione del protocollo di analisi. Dalla vasta gamma di pattern ricavati e' stata effettuata una suddivisione in 9 gruppi. In alcuni di essi vi erano gruppi di piante residenti in appezzamenti agrumicoli vicini. La clusterizzazione arbitraria degli isolati e' stata confermata dai dati ottenuti dalla caratterizzazione biologica e dalle analisi filogenetiche. Per poter consentire una migliore applicazione del metodo messo a punto e' stato anche predisposto un protocollo di analisi che combina, in maniera sequenziale, la tecnica molecolare CE-SSCP con il test immunologico DAS-ELISA. In tal modo e' possibile abbinare la rapidita' dello screening all'analisi della struttura genetica, risparmiando tempo e risorse. Il metodo e' altamente sensibile, semplice e particolarmente conveniente per l'analisi rapida di numerosi campioni. In tale circostanza consente di sviluppare una rapida caratterizzazione della variabilita' genetica di popolazioni di isolati del virus, risultando vantaggioso rispetto alla SSCP convenzionale, anche per la migliore risoluzione e per la possibilita' di accumulare i dati e di gestirli tramite un software.

Citrus tristeza virus (CTV), a viral species of the Closterovirus genus, is responsible for the most economically damaging disease of Citrus. It has killed over 85 millions of Citrus trees all over the world and made as many economically unproductives. Eradication programmes and use of CTV tolerant rootstocks are suitable to mitigate the negative effect of mild strains, whereas they are not effective against SP strains. Moreover, eradication is effective as long as the disease does not assume spread levels over 5%, otherwise it is suggested to pull out only those trees affected by severe strains aswell as cross-protection with mild strains or interfering RNA, being envisaged the future strategy to control the disease. For this reason, the development of new characterization techniques is becoming of important concern. In addition to the biological characterization (time consuming and costly), the most reliable techniques are the multiple-molecular-markers (labor consuming) and sequencing (not easy for many laboratories). Useful information can be achieved by the single stranded conformation polymorphism analysis (SSCP), which this doctoral research has empowered by performing the analysis through capillary electrophoresis. In this paper a novel fluorescence-based Capillary Electrophoresis Single Strand Conformation Polymorphism (CE-SSCP) protocol was applied for molecular characterization of CTV isolates. It combines the potentiality of single strand conformation analysis with automation and standardization of capillary electrophoresis. Three CTV isolates from Sicily (SG29, TDV, Tapi) and an exotic isolate (RPC3) previously characterized biologically were used in conventional SSCP and CE-SSCP analyses of partial p18 (425 bp), p23 (594 bp) and p25 (415 bp) genes. Profiles showed clear differences between SG29, RPC3, TDV and Tapi, altough the two latter isolates were similar, as expected, being originated from two close by plots and coming from the same nursery. Characterization of the clus-tered isolates were confirmed by data obtained from biological characterization and phylogenetic analysis. SG29 and RPC3 showed severe symptoms on the set of indicator plants, while Tapi and TDV showed typical symptoms of mild isolates. The phylogenetic analysis revealed that Tapi and TDV are localized in a cluster comprising the sequence variance of mild isolates, while SG29 and RPC3 belong to the cluster of virulent isolates. Based on these results a collection of 54 CTV isolates collected in different orchards of Sicily was analysed by CE-SSCP to further validate the protocol. A wide range of patterns was observed, tentatively placed in 9 groups. Clusters mostly included samples from trees originating from near-by infected trees, apparently infected with closely similar CTV isolates. Furthermore, in the present work we present a new protocol which combines the CE-SSCP molecular assay with DAS-ELISA immunological test in a sequential time. This new metodology allows the detection of CTV as well as the rapid analysis of the genetic structure of the isolates in a con-tinuous process. The method is highly sensitive, simple and very convenient for massive samples analysis. The technique enables rapid characterization of genetic variability within virus isolates, gives the best resolution compared to conventional SSCP and allows data accumulation and management through a specific software, thus saving both time and resources.